|  | | 牛胚胎移植操作程序及注意事项
[第一食品网 2008-7-11 14:20:00] |
| | | 牛的胚胎移植技术近几年已在我省广泛地应用于生产，但大多数都是购入胚胎进行移植，很多应用单位并不能完全掌握该项技术，为帮助有关人员了解该项技术并掌握其操作方法，提高牛胚胎移植水平，笔者将其在实践中的操作经验介绍如下。
1供、受体牛的选择
1.1品种供体（提供胚胎的牛）要选择有较高生产性能的优良种牛，要求品种特征明显，体型外貌和生产性能良好，遗传性能稳定，系谱清楚。受体（接受移植的牛）母牛一般选择本地黄牛、杂交牛及低产奶牛。
1.2年龄供牛在1.5～8岁为宜，从超排效果和便于冲胚考虑，最好是选择经产1～2胎的母牛。受体应选择年龄在8岁以内的性成熟母牛，处女母牛要注意选择体成熟并且体格大的。
1.3健康供、受体都要求健康无病，繁殖机能正常，没有流产史，产后60天以上，能观察到正常的发情周期，通过直肠检查子宫及卵巢发育正常，没有子宫炎症、卵巢囊肿和子宫过度弛缓、下垂等疾病。受体牛要选择体格较大，膘情中等以上的母牛。在人工授精时输精枪（针）不易通过子宫颈的牛一般不选用;长期空怀的母牛不得作供体;在用前列腺素处理或自然发情后的10天左右检查黄体发育不良，卵巢静止的母牛不选用。两次人工授精未受孕的母牛不能作受体牛。
1.4性情为便于冲胚操作和移植，供、受体牛要选择性情温顺的母牛;人不易接近，人工授精时爆燥不安的牛最好不选用。
2供、受体牛的饲养管理
营养是影响母牛繁殖能力的主要因素，因此供、受体牛都要加强饲养管理，要保证提供给母牛足够优质的青粗饲料、精料以及维生素和矿物质、盐，并保证清洁的饮水，做到精心管理，合理饲养。特别是在农村条件下饲养的受体母牛，更要加强营养，有条件的最好把它们集中起来统一管理，强化饲养1～2个月。
3供体牛的超数排卵处理方法
3.1超排药品国产或进口FSH，氯前列烯醇或进口PG和CIDR。
3.2超排程序供体母牛在发情后的第9～13天，连续4天早晚间隔12小时肌注FSH，在注射FSH的第3天用前列腺素处理以达到超数排卵的目的。在实际应用时，一般是同时处理多头供体和受体母牛，为达到同期化，常采用以下2种方法。
3.2.1两次PG十FSH法以国产氯前列烯醇和FSH为例，供体母牛在第1次肌注4ml氯前列烯醇后，间隔10天再次注射4ml氯前列烯醇，在第2次肌注氯前列烯醇后的第14天开始进行超排处理。FSH注射采用递减法进行注射（70/70;60/60;50/50;40/40），连续4天早晚间隔12小时注射，总量为440IU。注射氯前列烯醇后第2天（注射当天为0天），早晚各输精1次，第3天视牛的发情状况，再输配1次。
3.2.2CIDR+FSH法以澳大利亚进口药物为例，供体母牛在第1天植入阴道栓（CIDR），在第11天开始注射FSH。采用的是递减法（4ml/4ml;3ml/3ml;2ml/2ml;1ml/1ml），连续4天早晚间隔12小时注射。在第3天注射FSH的同时，上下午各注射1.5ml澳大利亚产PG，在第4天上午注射FSH时取出CIDR栓，注射PG后的第2天（注射当天为0天）上下午各输精1次，同样，再次输精与否视母牛的发情状况而定。
4冲胚程序
4.1冲胚时间在发情配种后的第7天（发情当天为0天）冲胚，也可在第6天或第8天冲胚。
4.2保定与麻醉供体牛按照人工授精的要求进行保定，对于个别不安静的牛可采用2%的普鲁卡因5～10ml作尾椎硬膜外麻醉或肌注2%的静松灵1ml。
4.3器械和冲胚液的准备所有器械必须严格按无菌要求进行消毒，在清洗的最后一次，一定要用双蒸以上的蒸馏水冲洗，在使用时，接触胚胎的器械容器要用冲卵液进行冲洗;冲胚前冲卵液要先预热（水浴锅或热水浸泡）到35～37℃。
4.3超排效果检查超排效果不能在输精时去摸卵巢的卵泡来判定，而是在冲胚前（或前一天）直肠检查牛的卵巢黄体个数来确定，通过检查可判断能冲出的胚胎个数。
4.4操作步骤（1）排粪及清洁阴部。主要用清洁温水清洗后用清毒毛巾或卫生纸擦干净，一般不用消毒药水，因其使用不当反而会对胚胎造成伤害。在插入开置棒或冲卵管时，由助手分开外阴将其直接插入阴道，避免污染。（2）采用直肠把握法，用开置棒打开子宫颈通道，开置棒插到子宫颈内口时退出。（3）助手将冲卵管先用冲卵液内外冲洗一遍，并检查气球是否完好后装入钢芯。（4）术者采用直肠把握法将冲卵管插入阴道，通过子宫颈将冲卵管插到角间沟时，由直肠内的左手引道，将冲卵管插入须冲洗的子宫角（左或右），当到达子宫角弯曲部位时，将钢芯退出约3cm，并把冲卵管继续向前推进，当钢芯再次到达子宫角弯曲部位时，再将钢芯退出少部分并将冲卵管向前推进，如此反复，直到冲卵管前端到达子宫角深部。由助手从冲卵管冲汽孔用注射器注入约9～18ml（根据子宫角大小确定）空气使汽球膨胀，堵住子宫角，关闭进气孔后，将钢芯取出开始冲胚。（5）助手用注射器吸取冲卵液，每次3.5～30ml，从冲卵管口推入子宫角，注入冲卵液后术者用直肠中的手将子宫角抬高，冲卵液体就会回流，用瓶子接住或直接用注射器回收即可。一般一侧子宫反复冲7次左右。开始注入冲卵液要少，后可逐渐增多，把握子宫颈的手开始也用不着按摩挤压，只是在最后一两次时稍加按摩，就能帮助排空液体。在冲洗完后可推两次空气入子宫角，帮助液体排空。
（6）如需冲另一侧子宫角，则按（3）（4）（5）重复操作即可。
（7）冲胚时每头牛用一个容器（瓶子或滤杯）装回收液，并要注意保温和避免污染。
4.5术后处理两侧子宫冲卵完毕后，将气球内的空气放掉，把冲卵管抽回至子宫体，直接从冲卵管灌注青霉素80万IU、链霉素100万IU和氯前列烯醇4ml（用双蒸水或生理盐水稀释），再拔出冲卵管。
5检胚
5.1检胚前的准备检胚的试验室及各种器具要事先作好消毒工作，如果气温低要提前进行升温，检胚的室温要求是25℃。
5.2过滤法回收将回收的冲胚液直接注入过滤杯中，将过滤杯中留下的35ml左右回收液倒入平皿中，用冲卵液冲
洗过滤杯2～3次，其液体一并冲入平皿中，然后在体视显微镜下找胚及镜检。
5.3沉淀法回收回收液静置20分钟后用塑料管吸去上清液，在吸时根据虹吸原理进行，要控制（用手握紧或放松出水口）液体的流速，使其缓慢流出，并注意把上面的气泡吸尽，当吸到液面还有2～2.5cm深时，将余下的液体倒入两个培养皿中镜检。
5.4找胚用体视显微镜放大6x1.5倍进行找胚。在找胚时平皿放在画有格子的平皿盖中进行检胚，这样可按顺序逐格寻找，一般反复2～3遍即可把所有胚胎检出。找到的胚胎用自制的玻璃微吸管（玻璃管拉丝，后面配上一节封口的塑料管）把胚胎取出。在吸取胚胎时玻璃微吸管要先吸满培养液，在吸管进入平皿液面以前，挤出少量培养液，用吸管口对着胚胎，将捏着塑料管的手指放松，胚胎就很容易吸入吸管，而且在液面不会产生气泡和丢失胚胎。检出的胚胎放入装有培养液的平皿中，找胚完后对检出的胚胎进行质量判定。
6胚胎的质量鉴定和分级
6.1放大倍数胚胎质量鉴定一般在放大60～200倍体视显微镜下进行，如果受体视显微镜放大倍数的限制30倍也行。
6.2鉴定依据在显微镜下根据卵子分裂与否，卵子的形态色调、分裂球大小、均匀度、细胞的密度、透明带以及变性情况等鉴定胚胎。一般冲出的卵子会有以下情况：（1）未受精卵一没有分裂球及胞团的卵子;（2）桑椹胚一发情后5～6天冲出的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球。占据透明带内腔的大部分;（3）致密桑椹胚一发情后第6～7天回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔的60%～70%;（4）早期囊胚一发情后第7～8天冲出的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明内腔的70%～80%，难以分清内细胞团和滋养层;（5）囊胚一发情后第7～8天回收的卵子，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔;（6）扩张囊胚一发情后第8～9天回收的卵子，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的1.2～1.5倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/3;（7）孵育胚-一般在发情后9～11天，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。
6.3胚胎的分级冲出的胚胎一般分为A、B、C、D四级。
A级一胚胎形态完整，轮廓清晰呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。B级一轮廓清晰。色调及细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡。C级一轮廓不清，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液体较多，变性的细胞达30%～50%。D级一未受精卵、16细胞以下受精卵、有碎片的退化卵及变性细胞超过一半的胚胎。
A、B、C级胚胎为可用胚胎，其中A、B级为可冷冻胚胎，C级胚胎只能用于鲜胚移植，D级胚胎为不可用胚胎。
7鲜胚移植
供、受体牛经过同期发情处理，从供体牛获得的胚胎可以马上移植到受体牛的子宫内。
7.1受体牛的同期化处理受体牛的同期化是指其发情时间与供体牛基本一致，相差时间最好提前一天，受体牛处理头数的比例一般为供体牛的5倍。
7.1.1前列腺素法（1）一次前列腺素法：在供体牛用前列腺素的前一天，对处于发情周期第10天的受体牛进行直肠检查，选择黄体好的受体牛一次肌肉注射氯前列烯醇2～4ml（按牛体重大小）诱导发情，发情后第7天进行移植。（2）二次前列腺素法：对经直肠检查空怀的受体牛注射一次氯前列烯醇2～4ml后11天再次肌注氯前列烯醇2～4m1，发情后第七天进行移植。
7.1.2阴道栓加前列腺素（CIDR+PG）法：对空怀的受体母牛任意一天放入含有孕酮的阴道栓，10天左右取出阴道栓，同时肌注4m1氯前列希醇，发情后第7天进行移植。
7.2胚胎冲洗在移植前要对胚胎进行冲洗，方法是在一个培养皿中，分别滴10～12滴培养液，每滴0.1ml左右，用玻璃微吸管吸入培养液，挤出少量培养液后，按前述的方法从培养液中取出胚胎放入第一滴培养液中，排空吸管，从第二滴培养液中吸入培养液，挤出少量培养液，从第一滴中吸出胚胎放入第二滴培养液中，如此反复直到最后一滴冲洗完毕。
7.3装细管及输胚器（枪）用0.25ml的塑料细管，先吸入约2cm长度的培养液，再吸入1cm长度的空气，再吸入胚胎，再吸入空气，再吸入培养液，细管的两头要留有空气间隔（即7段装胚法），整个过程用微型注射器吸入。输胚器的安装基本与细管精液输精枪相同，但要特别注意无菌操作，手不能直接触摸枪帽。装好后要注意保温和避免污染，一般用灭菌卫生纸或纱布包裹头部，并要尽快输入受体牛子宫。
7.4合理搭配受体和胚胎在对受体牛移植时，要考虑胚胎的发育情况和受体的发情时间。一般处于发情第6天的受体牛选用致密桑椹胚移植;处于发情第7天的受体牛选用早期囊胚移植;处于发情第8天的受体牛选用囊胚或扩张囊胚移植。
7.5输胚受体牛有两种来源，一是前面用同期化处理的受体牛，二是根据自然发情记录来确定。不管是哪一种方法在输胚前都必须确定受体牛处于发情周期的第7天（6～8天），并通过直肠检查卵巢上是否有明显的黄体存在，只有明确了黄体的存在并发育正常，才能进行输胚，而且胚胎必须输在有黄体一侧的子宫角深处。操作方法基本同人工授精，所不同的是输胚的部位在有黄体侧的子宫角深部。在插入输胚器前，先将塑料保护外套插入阴道，再插入输胚器。在操作时要尽量减少对子宫的刺激，避免子宫受伤，从插入输胚器到开始输胚的时间越短越好，一般要求最好在3分钟内完成操作。
8胚胎冷冻与解冻
一般在专门生产胚胎或进行鲜移植获得的可用胚多于受体牛时可将胚胎冷冻保存，下面以乙二醇为冷冻保护液的冷冻过程讲述如下。
8.1装管方法将冲洗过的胚胎装入0.25ml的细管中。过程如下：用微型注射器连接细管，吸人约2.5cm保存液--0.5cm空气--5cm冷冻液--5cm空气--含一枚胚胎的冷冻液5cm空气--0.5cm冷冻液--0.5cm空气--适量保存液，最后用细管封口塞封口。一般要制作一个标签，注明胚胎系普档案、冷冻方法、胚胎发育期及级别等贴在封口塞上。
8.2冷冻程序用自动或半自动胚胎冷冻议进行胚胎冷冻。程序如下：将胚胎冷冻议的冷冻室预冷至～5.5（植冰温度），将装有胚胎的细管放人冷冻室平衡5～10分钟，植冰，再平衡5～10分钟，然后以每分钟0.3℃的降温速度降温至～32℃，平衡10分钟后，将细管投入液氮保存。
8.3冻胚解冻用乙二醇为冷冻保护液制作的冷冻胚胎，可以解冻后像细管冻精人工授精操作那样直接移植。解冻程序是：从液氮中取出装有胚胎的细管--空气中10秒--放入35℃热水中10秒--灭菌棉擦干--拧下细管塞--装入输胚枪。
9妊娠诊断
在受体牛接受移植后两个月，通过直肠检查法就可确诊。
来源：《贵州畜牧兽医》 | | | | | | 免责声明：本文发布标题及内容，来自其他正规网络媒体，仅供参考、研究使用，不代表本站相关立场。
本文转摘的目的仅为更好地利用网络传播有益信息，无任何商业意图。
如果您认为转载本文侵犯了您的权利，请立即通知我们，我们将在第一时间进行删除或修改。
* 有关转载以及版权问题请拨打电话：0411-84542000-789进行联系。 | | | | | |
|
